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GB 5009.22-2016食品中黄曲霉毒素B1的测定应用

来源与性质：黄曲霉毒素（Aflatoxin，AF）最早被发现于1960年，是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢产物，种类繁多，目前已分离鉴定出12种以上，常见的有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、B2a、G2a、BM2a和GM2a等，其中以黄曲霉毒素B1分布最广、毒性最强、危害最大。黄曲霉毒素的热稳定性非常好，常规烹调和加热法不易分解。

应用领域：黄曲霉毒素B1存在于土壤，动植物各种坚果，特别是花生和核桃中。在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。一般以热带和亚热带等南方高温、高湿地区受污染最为严重，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。黄曲霉毒素耐热，280℃才可裂解，故一般烹调加工温度下难以破坏。

法规与标准：在中国，国家标准《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B1的限量GB 2761-2017》规定了食品中黄曲霉毒素B1的限量标准。根据该标准，不同食品中黄曲霉毒素B1的限量标准也有所不同。比如，谷类及谷类制品中黄曲霉毒素B1的限量标准为5μg/kg，花生及其制品中的限量标准为20μg/kg，食用油中的限量标准为5μg/kg。这些限量标准的制定，旨在降低食品中黄曲霉毒素B1的含量，减少公众摄入致癌物质的风险。

《GB 5009.22-2016食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》于2016年12月23日发布，2017年6月23日实施，第一法同位素稀释液相色谱-串联质谱法中，试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2，用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液提取,提取液用含1%TritonX-100(或吐温-20)的磷酸盐缓冲溶液稀释后，通过免疫亲和柱净化和富集，净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。

曼哈格参考《GB 5009.22-2016食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》，重现了国标第一法食用油中黄曲霉毒素B1的检测方法，采用BePure-20148LA（乙腈中黄曲霉毒素B1，10 μg/mL）标准溶液以及BePure-29111-1.2ml（乙腈中U-[13C17]-黄曲霉毒素B1，0.5μg/mL）同位素标准溶液，Besep黄曲霉毒素B1免疫亲和柱净化样品,C18色谱柱分离，液相色谱仪分离，串联质谱检测，外标法定量。

一、标准物质

单标：乙腈中黄曲霉毒素B1

货号：BePure-20148LA（乙腈中黄曲霉毒素B1，10μg/mL）

同位素单标：乙腈中U-[13C17]-黄曲霉毒素B1

货号：BePure-29111-1.2ml（乙腈中U-[13C17]-黄曲霉毒素B1，0.5μg/mL）

二、前处理

黄曲霉毒素B1免疫亲和柱：200ng 3mL

货号：66069

质控样品：大米粉中黄曲霉毒素B1

货号：BQC1011120148H

1标准溶液配制

标准储备溶液(1.0μg/mL):分别称取AFTB₁ (BePure-20148LA)1 mL，用乙腈溶解并定容至10mL。此溶液浓度为1μg/mL。

混合标准工作液(100ng/mL):准确移取混合标准储备溶液(1.0μg/mL)1.00mL 至10 mL 容量瓶中,乙腈定容。

混合同位素内标工作液(100ng/mL)：准确移取 0.5μg/mL13C17AFTB1各400μL，用乙腈定容至2mL。

标准系列工作溶液:准确移取混合标准工作液(100ng/mL)50 μL、100 μL、500 μL、1000μL、2000μL至10mL容量瓶中,加入200μL100ng/mL的同位素内标工作液,用初始流动相定容至刻度，配制浓度点为0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL的系列标准溶液。

2 提取

称取5g试样(精确至0.01g)于50 mL离心管中，加入100μL(100ng/mL内标溶液)，加入甲醇-水溶液(70+30)，涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡20min(或用均质器均质3 min），在6000 r/min下离心10 min，取上清液备用。

3净化

准确移取4 mL上清液，加入23 mL1%吐温-20的PBS，混匀。待免疫亲和柱内原有液体流尽后，将上述样液移至50 mL注射器筒中，调节下滴速度，控制样液以1 ml/min~3 ml/min的速度稳定下滴。待样液滴完后，往注射器筒内加入2×10 mL水，以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱。脱离真空系统,在亲和柱下部放置10 mL刻度试管，取下50 mL的注射器筒，加入2×1mL甲醇洗脱亲和柱，控制1mL/min~3mL/min的速度下滴，再用真空泵抽干亲和柱，收集全部洗脱液至试管中。在50℃下用氮气缓缓地将洗脱液吹至近干，加人1.0 mL初始流动相，涡旋30 s溶解残留物，0.22 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备进样。

三、仪器检测方法

液相色谱条件(Agilent)

a) 流动相:A相:5 mmol/L乙酸铵溶液；B相:甲醇

b) 梯度洗脱

c) 色谱柱：besil 3μm C18-H 100×4.6mm)

d) 流速：0.5 mL/min

e) 柱温：40℃

f) 进样体积：20μL

质谱条件(Agilent AB secix)：

a) 检测方式：多离子反应检测（MRM）

b) 离子源类型：电喷雾离子源

c) 扫描方式：正扫

d) 电喷雾电压：正离子5000V

e) 离子源温度：300℃

f) 离子源气体1：35Psi

g) 离子源气体2：35Psi

离子选择参数表

四、 检测结果

黄曲霉毒素B1 B2 G1 G2柱回收率验证

五、谱图

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