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R2A琼脂培养基（中国药典）/用于纯化水中菌落总数的测定

HB0167-5

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250g

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R2A琼脂培养基（中国药典）介绍：

用途：用于纯化水中菌落总数的测定，（EP、USP、Chp标准）

配方：

酵母浸出粉	0.5
蛋白胨	0.5
酪蛋白水解物	0.5
葡萄糖	0.5
可溶性淀粉	0.5
磷酸氢二钾	0.3
无水硫酸镁	0.024
丙酮酸钠	0.3
琼脂	15.0
pH值7.2 ± 0.2	25℃

用法：称取本品18.18g,加热溶解于1000ml纯化水中,分装三角瓶,121℃高压灭菌15分钟,备用。

注：培养基中有少量淀粉和硫酸镁，灭菌后可能会有微量沉淀。

检验原理：酵母浸出粉、蛋白胨、酸蛋白水解物提供氮源、维生素、生长因子；葡萄糖、为可发酵糖类；可溶性淀粉可以吸收菌在复苏过程产生的有害物质；丙酮酸钠可增强细菌的复苏。磷酸氢二钾为酸碱缓冲剂；无水硫酸镁提供二价阳离子；琼脂为凝固剂。

不同药典关于纯化水的微生物检测方法和质量标准

中国药典

【检查】微生物限度取本品不少于 1ml，按薄膜过滤法处理后，采用 R2A 琼脂培养基，30～35℃培养不少于 5 天，依法检查（通则 1105），每1ml 供试品中需氧菌总数不得过 100cfu。

操作简述：

除葡萄糖、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节 pH 值使加热后在 25℃的 pH值为 7.2±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。 R2A 琼脂培养基适用性检查试验照通则 1105 中“计数培养基适用性检查”的胰酪大豆胨琼脂培养基的适用性检查方法进行，试验菌株为铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌。应符合规定。

USP标准

在美国药典中，推荐使用0.45μm薄膜过滤法，并同时使用高营养培养基（平板计数琼脂培养基（PCA））于30-35℃培养72小时以上，和低营养培养基（R2A琼脂）于20-25℃培养96小时以上。检测标准为：≤100cfu/ml 。

操作简述：（可根据实际情况调整）

量取10ml充分混匀的水样，以无菌操作加入安装好的薄膜过滤器内，过滤。并用 pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml,共冲洗1次。过滤后，取出滤膜，正面朝上贴于琼脂平板上。共制备 2张滤膜，一张滤膜贴于平板计数琼脂培养基平板（高营养培养基）置30℃~35℃生化培养箱中倒置培养2~3天，计数。另一张滤膜贴于R2A琼脂平板（低营养培奍基），置20℃~25℃生化培养箱倒置培养5~7天，计数。以培养基平板上菌落数生长较多者作为检测结果，按比例折算为1ml纯化水中的微生物数量后报告。EP标准

在欧洲药典中使用薄膜过滤法（0.45μm 孔径滤膜），使用 R2A 琼脂培养基在 30℃～35℃培养 5 天以上。质量标准：≤100cfu/mL。

操作简述：（可根据实际情况训整）

量取 10ml 充分混匀的水样，以无菌操作加入安装好的薄膜过滤器内，过滤。并用 pH7.0 的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为 100ml，共冲洗 1 次。过滤后，取出滤膜，正面朝上贴于 R2A 琼脂平板上, 置 30℃～35℃生化培养箱中倒置培养 5 天，计数。按比例折算为 1ml 纯化水中的微生物数量后报告。

R2A琼脂微生物质控结果：

大肠埃希氏菌

白色菌落

金黄色葡萄球菌

白色菌落

铜绿假单胞菌

有绿色色素

R2A琼脂培养基的原理及应用:

R2A琼脂培养基(中国药典)微生物灵敏度试验:

按标签用法制备培养基，接种以下质控菌株，放置30-35℃需氧培养48-120小时。注：回收率计算时，用R2A琼脂做对照培养基。

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HBPP4114-100	胰酪大豆胨液体培养基（TSB）瓶装（100ml）Trypticase(Tryptic) Soy Broth	100ml*20瓶	一种通用的营养培养基，用于各种微生物的培养(丁基胶塞口)
HBPP8454-100	PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液瓶装（100ml）Buffered Sodium Chloride - Peptone Solution	100ml*20瓶	用于制备药品样品的稀释液或冲洗液
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一、中国药典2015年版四部（通则1105）相关标准解读

适用范围
适用于纯化水及制药用水系统中微生物限度的测定，尤其针对受氯气损伤的细菌复苏及生长缓慢的耐氯菌检测[5]。

核心检测方法
采用薄膜过滤法，取不少于1ml样品过滤后，使用R2A琼脂培养基在30℃条件下培养[5]。

检出限与定量限
• 培养时间延长至5-7天可显著提高检出率
• 最低检测限达1CFU/ml（需结合具体验证数据）[5]

质控样品要求
需使用铜绿假单胞菌（CMCC 10104）和枯草芽孢杆菌（CMCC 63501）进行培养基适用性验证，回收率应≥70%[5]。

关键实验步骤
1. 培养基配制：每升蒸馏水溶解15.2g干粉
2. 灭菌条件：121℃高压灭菌15分钟
3. pH控制：灭菌后pH需保持7.2±0.2[5]

特别说明
• 需在20-28℃环境培养5-7天
• 培养基灭菌后允许稍浑浊
• 不可使用结块或污染培养基[5]

[5] R2A琼脂培养基(2015药典)

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